Faktorët e ndërhyrjes në reaksionet PCR

Gjatë reaksionit PCR, shpesh hasen disa faktorë ndërhyrës.
Për shkak të ndjeshmërisë shumë të lartë të PCR-së, kontaminimi konsiderohet si një nga faktorët më të rëndësishëm që ndikojnë në rezultatet e PCR-së dhe mund të japë rezultate pozitive të rreme.
Po aq kritike janë edhe burimet e ndryshme që çojnë në rezultate të rreme negative. Nëse një ose më shumë pjesë thelbësore të përzierjes PCR ose vetë reaksioni i amplifikimit pengohen ose ndërhyhen, analiza diagnostikuese mund të pengohet. Kjo mund të çojë në ulje të efikasitetit dhe madje edhe në rezultate të rreme negative.
Përveç frenimit, humbja e integritetit të acidit nukleik të synuar mund të ndodhë për shkak të kushteve të transportit dhe/ose ruajtjes para përgatitjes së mostrës. Në veçanti, temperaturat e larta ose ruajtja joadekuate mund të çojnë në dëmtimin e qelizave dhe acideve nukleike. Fiksimi i qelizave dhe indeve dhe ngulitja në parafinë janë shkaqe të njohura të fragmentimit të ADN-së dhe një problem i vazhdueshëm (shih Figurat 1 dhe 2). Në këto raste, edhe izolimi dhe pastrimi optimal nuk do të ndihmojnë.

Figura 1 | Efekti i imobilizimit në integritetin e ADN-së
Elektroforeza në xhel agaroze tregoi se cilësia e ADN-së së izoluar nga seksionet e parafinës së autopsive ndryshonte ndjeshëm. ADN-ja me gjatësi mesatare të ndryshme të fragmenteve ishte e pranishme në ekstrakte në varësi të metodës së fiksimit. ADN-ja u ruajt vetëm kur u fiksua në mostra të ngrira native dhe në formalinë neutrale të tamponuar. Përdorimi i një fiksuesi Bouin fort acid ose formaline të patampuar që përmban acid formik rezultoi në një humbje të konsiderueshme të ADN-së. Fraksioni i mbetur është shumë i fragmentuar.
Në të majtë, gjatësia e fragmenteve shprehet në çifte kilobazash (kbp)

Figura 2 | Humbja e integritetit të objektivave të acidit nukleik
(a) Një boshllëk 3′-5′ në të dy fijet do të rezultojë në një thyerje në ADN-në e synuar. Sinteza e ADN-së do të ndodhë ende në fragmentin e vogël. Megjithatë, nëse mungon një vend i kalitjes së prajmerëve në fragmentin e ADN-së, ndodh vetëm amplifikimi linear. Në rastin më të favorshëm, fragmentet mund të ngopen njëri-tjetrin, por rendimentet do të jenë të vogla dhe nën nivelet e zbulimit.
(b) Humbja e bazave, kryesisht për shkak të depurinimit dhe formimit të dimerit të timidinës, çon në një ulje të numrit të lidhjeve H dhe një ulje të Tm. Gjatë fazës së zgjatur të ngrohjes, prajmerët do të shkrihen nga ADN-ja e matricës dhe nuk do të kaliten as në kushte më pak të rrepta.
(c) Bazat e timinës ngjitur formojnë një dimer TT.
Një problem tjetër i zakonshëm që ndodh shpesh në diagnostikën molekulare është çlirimi jo optimal i acideve nukleike të synuara në krahasim me nxjerrjen fenol-kloroform. Në raste ekstreme, kjo mund të shoqërohet me rezultate të rreme negative. Mund të kursehet shumë kohë duke zier lizën ose tretjen enzimatike të mbeturinave qelizore, por kjo metodë shpesh rezulton në ndjeshmëri të ulët të PCR për shkak të çlirimit të pamjaftueshëm të acidit nukleik.

Frenimi i aktivitetit të polimerazës gjatë amplifikimit

Në përgjithësi, frenimi përdoret si një koncept enësor për të përshkruar të gjithë faktorët që çojnë në rezultate jo optimale të PCR. Në një kuptim të ngushtë biokimik, frenimi kufizohet në aktivitetin e enzimës, d.m.th., ai zvogëlon ose parandalon konvertimin e substratit-produktit përmes ndërveprimit me vendin aktiv të ADN polimerazës ose kofaktorit të saj (p.sh., Mg2+ për ADN polimerazën Taq).
Komponentët në mostër ose tamponët dhe ekstraktet e ndryshme që përmbajnë reagentë mund ta pengojnë drejtpërdrejt enzimën ose të bllokojnë kofaktorët e saj (p.sh. EDTA), duke çaktivizuar kështu polimerazën dhe nga ana tjetër duke çuar në rezultate të reduktuara ose negative të rreme të PCR-së.
Megjithatë, shumë ndërveprime midis përbërësve të reaksionit dhe acideve nukleike që përmbajnë shënjestër përcaktohen gjithashtu si 'frenues të PCR'. Pasi integriteti i qelizës prishet nga izolimi dhe acidi nukleik çlirohet, mund të ndodhin ndërveprime midis mostrës dhe tretësirës përreth saj dhe fazës së ngurtë. Për shembull, 'pastruesit' mund të lidhen me ADN-në me një ose dy fije përmes ndërveprimeve jo-kovalente dhe të ndërhyjnë në izolim dhe pastrim duke zvogëluar numrin e shënjestrave që përfundimisht arrijnë në enën e reaksionit PCR.
Në përgjithësi, frenuesit e PCR janë të pranishëm në shumicën e lëngjeve trupore dhe reagentëve të përdorur për testet diagnostike klinike (ure në urinë, hemoglobinë dhe heparinë në gjak), shtesa dietike (përbërës organikë, glikogjen, yndyrë, jone Ca2+) dhe përbërës në mjedis (fenole, metale të rënda).

Frenuesit më të përhapur të PCR mund të gjenden në baktere dhe qeliza eukariote, ADN jo-shënjestër, makromolekulat që lidhen me ADN-në të matricave të indeve dhe pajisjet laboratorike si dorezat dhe plastikat. Pastrimi i acideve nukleike gjatë ose pas nxjerrjes është metoda e preferuar për heqjen e frenuesve të PCR.
Sot, pajisje të ndryshme të nxjerrjes automatike mund të zëvendësojnë shumë protokolle manuale, por rikuperimi dhe/ose pastrimi 100% i objektivave nuk është arritur kurrë. Frenuesit e mundshëm mund të jenë ende të pranishëm në acidet nukleike të pastruara ose mund të kenë efekt tashmë. Ekzistojnë strategji të ndryshme për të zvogëluar ndikimin e frenuesve. Zgjedhja e polimerazës së përshtatshme mund të ketë një ndikim të rëndësishëm në aktivitetin e frenuesit. Metoda të tjera të provuara për të zvogëluar frenimin e PCR janë rritja e përqendrimit të polimerazës ose aplikimi i aditivëve të tillë si BSA.
Frenimi i reaksioneve PCR mund të demonstrohet duke përdorur kontrollin e cilësisë së procesit të brendshëm (IPC).
Duhet treguar kujdes për të hequr të gjithë reagentët dhe tretësirat e tjera në kitin e nxjerrjes, siç janë etanoli, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanoli dhe fenoli, nga izolati i acidit nukleik me anë të një hapi të plotë larjeje. Në varësi të përqendrimit të tyre, ato mund të aktivizojnë ose pengojnë PCR-në.