Faktorët e ndërhyrjes në reaksionet e PCR

Gjatë reagimit të PCR, disa faktorë ndërhyrës shpesh hasen.
Për shkak të ndjeshmërisë shumë të lartë të PCR, ndotja konsiderohet të jetë një nga faktorët më të rëndësishëm që ndikojnë në rezultatet e PCR dhe mund të prodhojnë rezultate të rreme pozitive.
Po aq kritike janë burimet e ndryshme që çojnë në rezultate të rreme-negative. Nëse një ose më shumë pjesë thelbësore të përzierjes PCR ose reagimi i amplifikimit në vetvete pengohen ose ndërhyhen, analiza diagnostikuese mund të pengohet. Kjo mund të çojë në efikasitet të zvogëluar dhe madje edhe rezultate të rreme negative.
Përveç frenimit, humbja e integritetit të acidit nukleik të synuar mund të ndodhë për shkak të kushteve të transportit dhe/ose ruajtjes para përgatitjes së mostrës. Në veçanti, temperaturat e larta ose ruajtja jo adekuate mund të çojnë në dëmtimin e qelizave dhe acideve nukleike. Fiksimi i qelizave dhe indeve dhe ngulitja e parafinës janë shkaqe të njohura të copëzimit të ADN -së dhe një problem të vazhdueshëm (shiko Figurat 1 dhe 2). Në këto raste, edhe izolimi dhe pastrimi optimal nuk do të ndihmojnë.

Figura 1 | Efekti i imobilizimit në integritetin e ADN -së
Elektroforeza e xhelit agarozë tregoi se cilësia e ADN -së e izoluar nga seksionet parafinë të autopsive ndryshonte në mënyrë të konsiderueshme. ADN me gjatësi mesatare të ndryshme mesatare të fragmentit ishte e pranishme në ekstrakte në varësi të metodës së fiksimit. ADN -ja u ruajt vetëm kur fiksohej në mostrat e ngrira vendase dhe në formalin neutral të tamponuar. Përdorimi i një fiksues të fortë acid bouin ose të pakontrolluar, formalinë që përmban acidin formës rezultoi në një humbje të konsiderueshme të ADN-së. Fraksioni i mbetur është shumë i fragmentuar.
Në të majtë, gjatësia e fragmenteve shprehet në çifte kilobase (KBP)

Figura 2 | Humbja e integritetit të objektivave të acidit nukleik
(a) Një hendek 3′-5 ′ në të dy fillesat do të rezultojë në një ndërprerje të ADN-së së synuar. Sinteza e ADN -së do të ndodhë akoma në fragmentin e vogël. Sidoqoftë, nëse një sit i annealimit të abetareve mungon në fragmentin e ADN -së, ndodh vetëm amplifikimi linear. Në rastin më të favorshëm, fragmentet mund të rivlerësojnë njëra -tjetrën, por rendimentet do të jenë të vogla dhe nën nivele të zbulimit.
(b) Humbja e bazave, kryesisht për shkak të depurimit dhe formimit të dimerit të timidinës, çon në një ulje të numrit të lidhjeve H dhe një rënie në TM. Gjatë fazës së zgjatur të ngrohjes, abetaret do të shkrihen nga ADN -ja e matricës dhe nuk do të anned as në kushte më pak të rrepta.
(c) Bazat e timinës ngjitur formojnë një dimer TT.
Një problem tjetër i zakonshëm që shpesh ndodh në diagnostikimin molekular është lëshimi më pak se optimal i acideve nukleike të synuara në krahasim me nxjerrjen e fenol-kloroformës. Në raste ekstreme, kjo mund të shoqërohet me negativë të rremë. Shumë kohë mund të ruhet nga liza e vluar ose tretja enzimatike e mbeturinave të qelizave, por kjo metodë shpesh rezulton në ndjeshmëri të ulët PCR për shkak të lëshimit të pamjaftueshëm të acidit nukleik.

Frenimi i aktivitetit të polimerazës gjatë amplifikimit

Në përgjithësi, frenimi përdoret si një koncept i kontejnerit për të përshkruar të gjithë faktorët që çojnë në rezultate suboptimale të PCR. Në një kuptim rreptësisht biokimik, frenimi është i kufizuar në aktivitetin e enzimës, d.m.th., ajo zvogëlon ose parandalon shndërrimin e substratit-produktit përmes ndërveprimit me vendin aktiv të polimerazës së ADN-së ose kofaktorit të saj (EG, Mg2+ për polimerazën e ADN-së Taq).
Komponentët në mostër ose tamponët dhe ekstraktet e ndryshme që përmbajnë reagentë mund të pengojnë drejtpërdrejt enzimën ose të bllokojnë kofaktorët e saj (p.sh. EDTA), duke inaktivizuar kështu polimerazën dhe nga ana tjetër duke çuar në ulje të rezultateve të PCR negative.
Sidoqoftë, shumë ndërveprime midis përbërësve të reagimit dhe acideve nukleike që përmbajnë të synuar janë përcaktuar gjithashtu si 'frenues të PCR'. Pasi të lëshohet integriteti i qelizës nga izolimi dhe acidi nukleik lëshohet, mund të ndodhin ndërveprime midis mostrës dhe zgjidhjes së tij përreth dhe fazës së ngurtë. Për shembull, 'pastruesit' mund të lidhin ADN-në e njëanshme ose të dyfishtë përmes ndërveprimeve jo-kovalente dhe të ndërhyjnë në izolim dhe pastrim duke zvogëluar numrin e objektivave që përfundimisht arrijnë në anijen e reaksionit PCR.
Në përgjithësi, frenuesit PCR janë të pranishëm në shumicën e lëngjeve të trupit dhe reagentëve të përdorur për teste klinike diagnostikuese (ure në urinë, hemoglobinë dhe heparinë në gjak), shtesa dietike (përbërës organikë, glikogjen, yndyrë, jone Ca2+) dhe përbërës në mjedis (fenole, metale të rënda)

Frenuesit më të përhapur të PCR mund të gjenden në bakteret dhe qelizat eukariotike, ADN jo të synuar, makromolekulat që lidhen me ADN-në e matricave të indeve dhe pajisjeve laboratorike siç janë dorezat dhe plastika. Pastrimi i acideve nukleike gjatë ose pas nxjerrjes është metoda e preferuar për heqjen e frenuesve të PCR.
Sot, pajisje të ndryshme të automatizuara të nxjerrjes mund të zëvendësojnë shumë protokolle manuale, por 100% rikuperimi dhe/ose pastrimi i objektivave nuk është arritur kurrë. Frenuesit e mundshëm mund të jenë akoma të pranishëm në acidet nukleike të pastruara ose mund të kenë marrë tashmë në fuqi. Strategji të ndryshme ekzistojnë për të zvogëluar ndikimin e frenuesve. Zgjedhja e polimerazës së duhur mund të ketë një ndikim të rëndësishëm në aktivitetin e frenuesit. Metoda të tjera të provuara për të zvogëluar frenimin e PCR janë rritja e përqendrimit të polimerazës ose aplikimi i aditivëve siç është BSA.
Frenimi i reaksioneve PCR mund të demonstrohet nga përdorimi i Kontrollit të Cilësisë së Procesit të Brendshëm (IPC).
Duhet pasur kujdes për të hequr të gjithë reagentët dhe zgjidhjet e tjera në çantën e nxjerrjes, të tilla si etanol, EDTA, CETAB, LICL, GUSCN, SDS, izopropanol dhe fenol, nga izolimi i acidit nukleik me një hap të plotë të larjes. Në varësi të përqendrimit të tyre, ata mund të aktivizojnë ose pengojnë PCR.