Faktorët e ndërhyrjes në reaksionet PCR

Gjatë reaksionit PCR, shpesh hasen disa faktorë ndërhyrës.
Për shkak të ndjeshmërisë shumë të lartë të PCR, kontaminimi konsiderohet të jetë një nga faktorët më të rëndësishëm që ndikon në rezultatet e PCR dhe mund të prodhojë rezultate false pozitive.
Po aq kritike janë burimet e ndryshme që çojnë në rezultate false-negative. Nëse një ose më shumë pjesë thelbësore të përzierjes PCR ose vetë reaksioni i amplifikimit pengohen ose ndërhyhen, analiza diagnostike mund të pengohet. Kjo mund të çojë në reduktim të efikasitetit dhe madje edhe rezultate të rreme negative.
Përveç frenimit, humbja e integritetit të acidit nukleik të synuar mund të ndodhë për shkak të kushteve të transportit dhe/ose ruajtjes përpara përgatitjes së mostrës. Në veçanti, temperaturat e larta ose ruajtja e pamjaftueshme mund të çojë në dëmtimin e qelizave dhe acideve nukleike. Fiksimi i qelizave dhe indeve dhe futja e parafinës janë shkaqe të njohura të fragmentimit të ADN-së dhe një problem i vazhdueshëm (shih Figurat 1 dhe 2). Në këto raste, edhe izolimi dhe pastrimi optimal nuk do të ndihmojnë.

Figura 1 | Efekti i imobilizimit në integritetin e ADN-së
Elektroforeza e xhelit të agarozës tregoi se cilësia e ADN-së së izoluar nga seksionet parafine të autopsive ndryshonte ndjeshëm. ADN me gjatësi të ndryshme mesatare të fragmenteve ishte e pranishme në ekstrakte në varësi të metodës së fiksimit. ADN-ja u ruajt vetëm kur u fiksua në mostrat e ngrira amtare dhe në formalinë neutrale të buferuar. Përdorimi i një fiksuesi Bouin me aciditet të fortë ose i formalinës së pabuferuar, që përmban acid formik, rezultoi në një humbje të konsiderueshme të ADN-së. Pjesa e mbetur është shumë e fragmentuar.
Në të majtë, gjatësia e fragmenteve shprehet në çifte kilobase (kbp)

Figura 2 | Humbja e integritetit të objektivave të acidit nukleik
(a) Një hendek 3'-5' në të dy vargjet do të rezultojë në një thyerje në ADN-në e synuar. sinteza e ADN-së do të ndodhë ende në fragmentin e vogël. Megjithatë, nëse një vend i pjekjes së primerit mungon në fragmentin e ADN-së, ndodh vetëm amplifikimi linear. Në rastin më të favorshëm, fragmentet mund të ngopin njëri-tjetrin, por rendimentet do të jenë të vogla dhe nën nivelet e zbulimit.
(b) Humbja e bazave, kryesisht për shkak të depurinimit dhe formimit të dimerit timidin, çon në një ulje të numrit të lidhjeve H dhe një ulje të Tm. Gjatë fazës së zgjatur të ngrohjes, primerët do të shkrihen larg ADN-së së matricës dhe nuk do të pjekja edhe në kushte më pak të rrepta.
(c) Bazat fqinje të timinës formojnë një dimer TT.
Një problem tjetër i zakonshëm që shfaqet shpesh në diagnostikimin molekular është çlirimi më pak se optimal i acideve nukleike të synuara në krahasim me nxjerrjen e fenol-kloroformit. Në raste ekstreme, kjo mund të shoqërohet me negativë të rremë. Shumë kohë mund të kursehet nga liza e zierjes ose tretja enzimatike e mbetjeve qelizore, por kjo metodë shpesh rezulton në ndjeshmëri të ulët PCR për shkak të lëshimit të pamjaftueshëm të acidit nukleik.

Frenimi i aktivitetit të polimerazës gjatë amplifikimit

Në përgjithësi, inhibimi përdoret si koncept kontejner për të përshkruar të gjithë faktorët që çojnë në rezultate jo optimale të PCR. Në një kuptim rreptësisht biokimik, frenimi kufizohet në aktivitetin e enzimës, dmth, ai redukton ose parandalon konvertimin substrat-produkt nëpërmjet ndërveprimit me vendin aktiv të polimerazës së ADN-së ose kofaktorit të saj (p.sh. Mg2+ për Taq ADN-polimerazën).
Komponentët në kampion ose buferë dhe ekstrakte të ndryshëm që përmbajnë reagentë mund të frenojnë drejtpërdrejt enzimën ose të bllokojnë kofaktorët e saj (p.sh. EDTA), duke inaktivizuar kështu polimerazën dhe nga ana tjetër duke çuar në ulje ose rezultate të rreme negative të PCR.
Megjithatë, shumë ndërveprime ndërmjet komponentëve të reaksionit dhe acideve nukleike që përmbajnë objektiv janë përcaktuar gjithashtu si 'frenues PCR'. Pasi integriteti i qelizës prishet nga izolimi dhe acidi nukleik lirohet, mund të ndodhin ndërveprime midis mostrës dhe tretësirës së tij përreth dhe fazës së ngurtë. Për shembull, 'pastruesit' mund të lidhin ADN-në me një ose dy-vargësh përmes ndërveprimeve jokovalente dhe të ndërhyjnë në izolimin dhe pastrimin duke reduktuar numrin e objektivave që përfundimisht arrijnë në enën e reagimit PCR.
Në përgjithësi, frenuesit e PCR janë të pranishëm në shumicën e lëngjeve dhe reagentëve të trupit që përdoren për teste diagnostike klinike (ure në urinë, hemoglobinë dhe heparinë në gjak), suplemente dietike (përbërës organikë, glikogjen, yndyrë, jone Ca2+) dhe përbërës në mjedis (fenole , metale të rënda)

Frenuesit më të përhapur të PCR-së mund të gjenden në bakteret dhe qelizat eukariote, ADN-në jo të synuar, makromolekulat që lidhin ADN-në e matricave të indeve dhe pajisjet laboratorike si dorezat dhe plastika. Pastrimi i acideve nukleike gjatë ose pas ekstraktimit është metoda e preferuar për heqjen e frenuesve PCR.
Sot, pajisje të ndryshme të automatizuar të nxjerrjes mund të zëvendësojnë shumë protokolle manuale, por rikuperimi 100% dhe/ose pastrimi i objektivave nuk është arritur kurrë. Frenuesit e mundshëm mund të jenë ende të pranishëm në acidet nukleike të pastruara ose mund të kenë hyrë tashmë në fuqi. Ekzistojnë strategji të ndryshme për të reduktuar ndikimin e frenuesve. Zgjedhja e polimerazës së përshtatshme mund të ketë një ndikim të rëndësishëm në aktivitetin e frenuesit. Metoda të tjera të provuara për të reduktuar frenimin e PCR janë rritja e përqendrimit të polimerazës ose aplikimi i aditivëve si BSA.
Frenimi i reaksioneve PCR mund të demonstrohet me përdorimin e kontrollit të brendshëm të cilësisë së procesit (IPC).
Duhet pasur kujdes për të hequr të gjithë reagentët dhe tretësirat e tjera në kompletin e ekstraktimit, të tilla si etanoli, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, izopropanoli dhe fenoli, nga izolimi i acidit nukleik me një hap larjeje të plotë. Në varësi të përqendrimit të tyre, ato mund të aktivizojnë ose pengojnë PCR.